pcr'de çok fazla şablon

Bir PCR'deki toplam DNA miktarı, bir PCR prosedürünün sonucu üzerinde belirgin bir etkiye sahiptir. Çok fazla toplam DNA kullanılması, reaksiyon kabının sınırlı alanında paketlenmiş DNA ile sonuçlanır ve büyük Taq polimeraz moleküllerinin engellenmiş difüzyonu nedeniyle yanlış hazırlamaya ve hatta zayıf DNA sentezine yol açabilir.

1. PCR'ye ne kadar şablon eklemeliyim??
2. Çok fazla primer PCR'yi engelleyebilir mi??
3. PCR reaksiyonunun başarısız olmasına ne sebep olabilir??
4. PCR için ne kadar DNA yeterlidir?

PCR'ye ne kadar şablon eklemeliyim??

Teoride, şablonun bir molekülü yeterli olsa da, klasik bir PCR için tipik olarak önemli ölçüde daha büyük miktarlarda DNA, örneğin 1 µg'a kadar genomik memeli DNA'sı ve 1 pg kadar az plazmit DNA'sı kullanılır (1).

Çok fazla primer PCR'yi engelleyebilir mi??

dNTP karışımındaki kirleticiler, eksik veya yanlış amplifikasyona veya PCR inhibisyonuna neden olabilir. Yüksek kaliteli dNTP'ler kullanın. Aşırı konsantrasyonda primer kullanmak, primerlerin şablon üzerindeki istenmeyen bölgelere veya birbirlerine spesifik olmayan bir şekilde bağlanma şansını artırabilir.

PCR reaksiyonunun başarısız olmasına ne sebep olabilir??

PCR reaksiyonunun sadece bir bileşenini unutmak, bu ister DNA polimeraz olsun, ister primerler veya hatta şablon DNA olsun, başarısız bir reaksiyonla sonuçlanacaktır. En basit çözüm reaksiyonu tekrarlamaktır. ... Bundan sonra hala bir PCR ürünü yoksa, reaksiyonunuzu engelleyen başka bir şey olma ihtimali vardır.

PCR için ne kadar DNA yeterlidir?

Tipik bir 50 µL reaksiyonda, hedef DNA'nın amplifikasyonu için 1-2 ünite DNA polimeraz yeterlidir. Ancak zor kalıplarla enzim miktarlarının ayarlanması gerekebilir. Örneğin, DNA örneğinde inhibitörler mevcut olduğunda, DNA polimeraz miktarının arttırılması PCR verimini iyileştirebilir.